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技术支持

HPLC中流动相的配置的小妙招
发布时间:2016-09-10   点击次数:2254次

样品配置的小妙招:

 1.选用流动相配置对色谱峰影响zui小

 2.流动相溶解度达不到要求时,尽量选用流动相中含有的比例较大的成分(有待考证),以减轻进样对流动相的影响造成基线不稳。

 3.流动相组成溶剂均达不到要求时,选取的溶剂应保证在设定波长内无紫外吸收。

  流动相的PH

      如需在一定PH值下操作,须定期测定流动相的PH值,大气中的CO2溶解在流动相内将引起PH值的改变,特别是贮液瓶密闭不严时这种影响可能更大。

 更换柱子及流动相

       软质或半软质填料的溶胀率随溶剂极性的变化而变化,使用新柱时应先用25~30倍柱容积的合适流动相平衡;更换流动相时,如果两种流动相不互溶,需采用过渡溶剂使前一种流动相逐步溶解除去,(例如,2、2、4-三甲基戊烷换成甲醇时,必须用乙酸已酯或其他溶剂过渡,直到标准物保留值达到稳定状态)。

 

HPLC中流动相的配置必须注意以下几点:

 流动相的选择

 流动相的混合

    双泵主要是在探讨流动相的配比或者梯度洗脱是比较方便,知道确切的液相条件时,建议配好后使用的话,混合比较均匀,效果较好。

脱气

 HPLC所用流动相必须预先脱气,否则容易在系统内逸出气泡,影响泵的工作。

 系统中气泡的产生:流动相本身存在,梯度淋洗混合后放出气泡;

 气泡的影响:存在于管路中,系统压力不稳定,实验结果有偏差;

 存在于单向阀中,易造成液体回流,流量不准确,甚至是不吸液;

 存在于检测器中,出现鬼峰,影响检测准确性。

        所以做液相对流动相的气泡和杂质要求比较严格。气泡会影响柱的分离效率,检测器的灵敏度、基线稳定性,甚至使无法检测。(噪声增大,基线不稳,突然跳动)。此外,溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相(如烷基胺)反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化,对分离或分析结果带来误差。  

      溶解氧能与某些溶剂(如,甲醇、四氢呋喃)形成有紫外吸收的络合物,此络合物会提高背景吸收(特别是在260nm以下),并导致检测灵敏度的轻微降低,但更重要的是,会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰(假峰)。在荧光检测中,溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象,特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下,荧光响应可降低达95%。在电化学检测中(特别是还原电化学法),氧的影响更大。除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能,也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。

       常用的脱气方法有:加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混合溶剂,若采用抽气或煮沸法,则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。

 1.氦气脱气:氦气脱气是很有效的脱气方法。氦气缓缓的通过流动相赶去溶入的空气,如果使用得当,在10min内可除去80%~90%的溶入气体。由于氦气在流动相中的溶解度极低,所以用氦气脱气保护的流动相可以认为是一个无气体溶解体系。其缺点是氦气价格比较昂贵,会增加检验成本。一般说来有机溶剂中的气体易脱除,而水溶液中的气体较顽固。在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法,这种连续脱气法在电化学检测时经常使用。但氦气昂贵,难于普及。

 2.真空脱气:也是比较常用的脱气方法。现在多数企业都zui常用这种办法,贮液器被抽成部分真空,溶入的气体蒸发形成气泡溢出,其效果仅次于氦气脱气。象Agileng1200液相色谱使用的是在线脱气机。在线脱气只适合脱完气之后的流动相,在使用过程中的微量脱气。

 3.超声波脱气:将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10~20min。这种方法比较简便,又基本上能满足日常分析操作的要求,所以,目前仍广泛采用。这种方法只能除去30%的溶解气体,有时还会引起气体溶解度的增加。对氧敏感的检测器不宜用此法。

 4.加热回流脱气:该方法虽然效果很好,但是适用范围较窄。对于有机溶剂或混合流动相不适合用此法,因为挥发性组分会损失掉,改变流动相的组成。

      综合来说,用真空抽滤后,再用超声脱气还是zui常用的办法,用氦气的方法是效果的办法,而在线脱气本身也是真空脱气,但它可以放到仪器上使用,是一种保证性的办法。

 A.离线(系统外)脱气法不能维持溶剂的脱气状态,在你停止脱气后,气体立即开始回到溶剂中。在1~4小时内,溶剂又将被环境气体所饱和。

 B.在线(系统内)脱气法无此缺点。zui常用的在线脱气法为鼓泡,即在色谱操作前和进行时,将惰性气体喷入溶剂中。严格来说,此方法不能将溶剂脱气,它只是用一种低溶解度的惰性气体(通常是氦)将空气替换出来。此外还有在线脱气机。 

 

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